Apronex zajišťuje přípravu syntetických peptidů včetně následné konjugace peptidu s KLH nebo BSA.

Testování exprese proteinu

Prokaryotická exprese

Test exprese ve vybraném bakteriálním kmeni E. coli zahrnuje optimalizaci kombinace insert / vektor / hostitel, přípravu fragmentu a vektoru, ligaci, transformaci, následnou izolaci,sekvenaci a uchovávaní DNA správných klonů. Sekvenací ověřená DNA je transformována do hostitelských buňěk a exprese proteinu je analyzována pomocí SDS-PAGE nebo Western blotu. Vliv média, teploty a indukčních podmínek na expresi proteinu je určen experimentálně pro jednotlivé proteiny. Míra exprese a distribuce proteinu mezi rozpustnou a nerozpustnou buněčnou frakci je analyzována pomocí SDS-PAGE nebo Western blotu.

Eukaryotická exprese

Transientní exprese v savčích buňkách : Transientní exprese v savčích buňkách zahrnuje transfekci Vámi dodaného nebo námi připraveného expresního vektoru do vhodné buněčné linie a selekci pomocí antibiotické nebo jiné rezistence. Buněčný růst a životnost jsou monitorovány a exprese proteinu je analyzována pomocí metod SDS-PAGE/Western blot/dot blot.

Stabilní exprese v savčích buňkách: Stabilní exprese v savčích buňkách zahrnuje kultivaci buněk, monitorování růstu a životnosti buněk. Exprese proteinu je identifikována pomocí metod SDS-PAGE/Western blot/dot-blot.

Exprese v kvasinkových buňkách Pichia pastoris: Test exprese v kvasinkových buňkách spočívá v zaklonování požadovaného genu do vhodného expresního vektoru, transformaci do kompetentních buněk, izolaci DNA a sekvenaci. Sekvenací ověřená DNA je transformována do hostitelských buněk a exprese proteinu je analyzována pomocí SDS-PAGE, Western blotu nebo dot-blotu. Optimální podmínky pro expresi proteinu jsou stanoveny experimentálně a ověřeny pomocí SDS-PAGE.

Produkce rekombinantních proteinů

Na základě zadání zákazníka nabízíme kompletní servis pro vývoj stabilní produkce rekombinantních proteinů. Služba zahrnuje přípravu expresních plazmidů pro prokaryotní nebo eukaryotní expresi s použitím dodaného DNA templátu nebo templátu z naší databáze. Kódující sekvence je optimalizována pro maximální kvalitativní a kvantitativní produkci proteinu v daném expresním systému systému. Pro expresi je vybrán klon s nejvyšší produkcí. Rekombinantní proteiny jsou dodávány buď s afinitním tagem (His-Tag) nebo prostý jakéhokoli tagu.

Kultivace

Prokaryotická kultivace

Kultivace v buňkách E. coli zahrnuje transformaci expresního vektoru s požadovaným genem do vhodných kompetentních buněk, přípravu inokula a kultivaci buněk v malém objemu (do 5,5 l media) nebo po dohodě ve velkém objemu ve fermentoru (do 1000l media). V procesu exprese proteinu jsou vzorky biomasy sbírány ve 3 bodech fáze růstu. Všechny odebírané vzorky jsou po kultivaci biomasy analyzovány pomocí SDS-PAGE a nebo Western blot.

Eukaryotická exprese

Eukaryotická kultivace v savčích buňkách transientních linií zahrnuje transfekci Vámi dodaného nebo námi vyvinutého expresního vektoru do hostitelských buněk, kultivaci (v malých objemech do 5 ml media nebo ve velkých objemech do 0,5 l media) a následné monitorování exprese proteinu.
Eukaryotická kultivace v kvasinkových buňkách Pichia pastoris spočívá v transformaci expresního vektoru do kompetentních buněk, kultivaci a monitorování exprese proteinu pomocí SDS-PAGE, Western blotu nebo dot-blotu.
Purifikace
Proteiny jsou purifikovány standardní chromatografickými postupy do vysoké koncentrace a čistoty. Chromatografické metody purifikace běžně používané v našich laboratořích jsou:

gelová filtrace
iontově-výměnná chromatografie
purifikace využívající afinitu k purifikačním značkám
purifikace pomocí imunosorbentů nebo sorbentů s hydrofobní interakcí.
Všechny purifikační kroky jsou průběžně monitorovány pomocí absorbance při 280 nm. Jednotlivé frakce purifikačního procesu jsou obvykle analyzovány metodami SDS-PAGE, v případě potřeby mohou být použity jiné testy.

Proteinový refolding
Jevem, provázejícím expresi proteinů, bývá tvorba nerozpustných útvarů tzv. inkluzních tělísek v bakteriální cytoplasmě. K produkci rekombinantního proteinu do inkluzních tělísek může docházet z mnoha různých důvodů (toxicita rekombinantního proteinu pro bakteriální metabolismus, nepřítomnost vhodného chaperonu atd.), přičemž zastoupení rekombinantního proteinu bývá v inkluzních tělíscích velice významné. Výhodou tvorby proteinu ve formě inkluzních tělísek je, že jsou tělíska snadno oddělitelná od bakteriálního cytosolu. Inkluzní tělíska se obvykle rozpouštějí vysokými koncentracemi močoviny nebo guanidinium chloridu.
Naše laboratoř testuje různé podmínky re-foldingu, např.:

Dialýza (postupné snižování koncentrace močoviny v roztoku)
Ředění
Neionogenní detergenty
Lipidy
Glycerol, sacharóza
EDTA
In vivo folding – enzymy (disulfid isomerase, chaperony)
Odstranění endotoxinů (LPS)
Běžné purifikační metody proteinů (např. ultrafiltrace, iontovýměnná chromatografie apod.) nejsou pro odstranění endotoxinů obvykle dostatečné. Naše laboratoř nabízí službu účinného odstranění endotoxinů (LPS) z roztoku i v případě jejich přítomnosti v nízké koncentraci.

Lze odstranit endotoxiny z vodných roztoků obsahující nízkomolekulární nebo vysokomolekulární látky (proteiny, peptidy, protilátky nebo plasmidovou DNA).

Dodací podmínky (Produkce rekombinantního proteinu)
Cena a dodací podmínky závisí na zvoleném expresním systému a typu rekombinantního proteinu.